Terapia Epigenòmica en la Toxoplasmosis

Tema: Control epigenético de las respuestas del huésped IFN-γ durante la infección por Toxoplasma gondii

Mecanismo epigenòmico tratado: metilaciòn del ADN

Còmo se lo hizo: Se determinó mediante análisis de curva de fusión sensible a la metilación (MS-MCA) después del tratamiento con bisulfito del ADN genómico se aisló el ADN de las células RAW264.7 infectadas y no infectadas con T. gondii, utilizando el QIAamp DNA. Y se convirtieron con bisulfito cantidades iguales de ADN utilizando Methylation-Lightning de ADN. El estándar de ADN metilado universal se convirtió en bisulfito en paralelo y se utilizó como control positivo.

 

Resultados: 

Hubo modificaciones de histonas por lo que vemos cómo T. gondii manipula la capacidad de respuesta de las citocinas, monocitos/macrófagos a través de la interferencia con el entorno de la cromatina en un subconjunto de promotores que responden a STAT1. 

También revelan conocimientos sobre la regulación de la expresión génica mediada por IFN-γ en células monocíticas , en los promotores de los genes de respuesta primaria y secundaria eliminados por T. gondii, mientras que la metilación del ADN no se vio afectada durante la infección.

Utilizando reporteros de luciferasa vemos que la cromatina nativa es indispensable para que T. gondii inhiba la expresión génica regulada por IFN-γ.

Referencias Bibliograficas: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7544956/

Técnica de Edición de Acidos Nucléicos en la Toxoplasmosis

Tema: Editando el genoma de Toxoplasma gondii por es sistema CRISPR / Cas9
Tipo de Edición: No Aplica
Dirigido hacia: Knocking out del gen de toxoplasma KU80
Dirigido por: sistema CRISPR / CAS9, ARNsg
Organo a tratar: Cerebro, ojos, pulmones.
Vía de administración: mutagénesis química.

Resultados 

a corto plazo: crear grupos de mutantes de diferentes tamaños en el parásito (T. gondii) y tener un contorno optimizado en el enfoque de examen para bibliotecas de pequeña escala.

mediano plazo: disminución en el nivel de expresión de CLAMP y hacer inhibición en una invasión debido a los defectos en formación de placa.

largo plazo: trans-rescate latente de knock-out, líneas de eliminación del factor de virulencia MYR1 del parasito.

Fuente Bibliografica: 

https://www.researchgate.net/profile/Musafer-Alardi/publication/347932497_Article_Review_Editing_genome_of_Toxoplasma_gondii_by_CRISPRCas9_system/links/5fe80c4545851553a0f5be64/Article-Review-Editing-genome-of-Toxoplasma-gondii-by-CRISPR-Cas9-system.pdf

Ejemplo de Terapia con Stem Cells en la Toxoplasmosis

T. gondii indujo la activación del huésped p-AKT, p-ERK1 / 2 y p-p38 MAPK en células ARPE-19 dependiente de la carga de parásitos. La expresión de VEGF disminuyó después del pretratamiento con inhibidores de PI3K, inhibidor de ERK1 / 2 e inhibidor de p38 MAPK.

El agente anti-VEGF bevacizumab o la transfección de ARNip de VEGF inhibió de manera prominente la activación de p-AKT y p-ERK1 / 2,  en células ARPE-19 infectadas con T. gondii, tambien inhibieron la proliferación de taquizoítos de T. gondii en la célula huésped. 

En conjunto, T. gondii induce de manera prominente la producción de VEGF en las células ARPE-19, y las vías de señalización de VEGF y AKT / ERK1 / 2 se regulan mutuamente en las células ARPE-19 infectadas con T. gondii. VEGF y VEGF-R2 controlan la proliferación del parásito en células ARPE-19 infectadas con T. gondii. 

Stem Cells: ARPE-19

Metodo de Obtencion: Cell Signaling Technology Inc, Sigma (St. Louis, MO), Calbiochem (San Diego, CA) y Roche Korea (Diagnostics Korea, Corea).
Via de Administracion: transfección de ARNip de VEGF

Fuente Bibliografica: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7216739/

ADN recombinante artificial en la Toxoplasmosis

Se produjo la proteína recombinante GRA-4 (rGRA-4) como candidato para un kit de diagnóstico de toxoplasmosis utilizando el plásmido PET SUMO.

Las muestras utilizadas fueron ADN de taquizoítos de T. gondii. El GRA-4 amplificado de ADN de T. gondii se clonó en el vector de clonación pET-SUMO. Se secuenció el gen GRA-4, seguido de transformación de plásmido, aislamiento de ADN plasmídico recombinante y expresión de proteína recombinante en células competentes DE3.

Se obtuvo un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de GRA-4 del aislado local que se clonó  y mostró una homología del 99,61% con el GRA-4 predicho de T. gondii.

T: Clonación y expresión de la proteína recombinante GRA-4 de Toxoplasma gondii como candidato a kit de diagnóstico de toxoplasmosis.

O: Producir la proteína recombinante GRA-4 de un aislado local de Toxoplasma gondii como candidato para un kit de diagnóstico de toxoplasmosis en Escherichia coli BL21 (DE3)

G: TgPI-1 (rTgPI-1), ROP2 (rROP2) y GRA-4 (rGRA-4)/ 1036 bp

ER: no se usaron

EL: ... no especifica

Vectores: pET-SUMO

Celulas Receptoras: Procariota: cepa de E. coli utilizada fue BL21 (DE3)

MTG: Transformacion bacteriana por choque termico.

MIC: Cultivo, PCR, secuenciacion, ELISA.

Bibliografia:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33281340/

Técnica de hibridación para la Toxoplasmosis

La tecnología de biosensor de ADN electroquímico desarrollada para la detección voltamétrica de hibridación de ADN selectiva de secuencia relacionada con el Toxoplasma gondii se detecta midiendo la señal de oxidación de guanina que se produjo en presencia de hibridación de ADN. 

La sonda de captura de Toxoplasma gondii se inmovilizó sobre la superficie de la PGE activada mediante absorción en húmedo y se determinó el grado de hibridación en la superficie de PGE entre la sonda y la diana midiendo la señal de guanina observada. Esta plataforma de biosensor de un solo uso se aplicó con éxito para la detección de la hibridación de ADN relacionada con Toxoplasma gondii en amplicones de PCR.

Fuente Bibliografica:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26717837/

Prueba PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para la Toxoplasmosis

Dos dianas multicopia (B1 y Rep529) se utilizan comúnmente en los ensayos de PCR de T. gondii, gracias a un primer o cebador que ayude a la prueba a detectar estos genes.

Los límites inferiores de detección para los componentes B1 y Rep529 del ensayo de doble diana se determinaron utilizando diluciones en serie de la cepa Z185 de T. gondii cultivada. El ensayo de doble objetivo se utilizó luego para analizar 148 muestras intraoculares archivadas (132 vítreo, 16 humor acuoso). 

El diseño de doble objetivo puede garantizar la detección de T. gondii cuando hay variación en una de las dos regiones objetivo.

Fuente Bibliográfica:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30636207/

Alteraciones de la Epigenómica en la Toxoplasmosis

El genoma de T. Gondii está compuesto por 61.6 megabases y 592 cM, constituido en unidades genéticas de 104 kb/cM y 14 cromosomas

Nichols y cols en 1983 reportan antígenos de excreción y secreción de T. gondii localizados en diferentes organelos del taquizoíto de T. gondii como son roptrías, micronemos y gránulos densos donde se almacenan productos altamente inmunogénicos que son secretados intra y extracelularmente por el parásito, donde resalta el estudio de la molécula de Glycosilfosfatoinsoitol (GPI) que juega un papel importante en el anclaje de proteínas de membrana de T. gondii.

Para hablar acerca de la epigenómica debemos ver a esta enfermedad en el momento en que se vuelve congénita y esto se puede dar mediante transmisión intra útero de madre a hijo mediante la placenta, durante el parto o en el tiempo de la lactancia materna.

Fuente Bibliográfica:

https://www.researchgate.net/profile/Ma_Galvan-Ramirez/publication/298214396_Toxoplasmosis_Animal/links/5ab190d4458515ecebece5e3/Toxoplasmosis-Animal.pdf#page=17